Het klooster is ontstaan uit een gemeenschap van zusters van Het Gemene Leven, in het begin van de vijftiende eeuw. In 1454 krijgen zij van de bisschop (van Luik) toestemming om een biechtvader te mogen kiezen. Vijf jaar later kopen ze het klooster van de Windmolenberg van de derde orde zusters die zich daar gevestigd hadden.

In 1466 verheft bisschop Louis de Bourbon van Luik hen tot reguliere kanunnikessen en mogen zij een eigen kerk en kerkhof bezitten. Het is onduidelijk hoeveel religieuzen er in de eerste eeuw van haar bestaan in dit klooster hebben gewoond. Uit 1570 en 1574 weten we iets méér, als de Bossche bisschop Metsius alle kloosters in zijn bisdom een bezoek brengt na de Beeldenstorm. Op 13 maart 1570 geeft hij de zusters enige nadere opdrachten, waartegen de religieuzen protesteren, het resultaat is, dat er nog strengere maatregelen worden genomen. In het verslag van de visitatie van 23 juli 1574 merkt hij op dat er toen 32 koorzusters waren en 21 werkzusters. De vrouwelijke religieuzen mochten ook na de val van de stad in hun klooster blijven wonen. In 1648, toen de Vrede van Munster gesloten werd en definitief de Opstand was afgelopen, trokken de zusters weg, naar het katholieke zuiden. Als zij in 's-Hertogenbosch zouden blijven, zouden zij langzamerhand uit moeten sterven; in hun nieuwe woonplaats zouden zij nieuwe kloosterlingen kunnen aantrekken. Bovendien kregen zij van de Staten een jaarwedde, die ook uitgekeerd zou worden in Vilvoorde. Aan het eind van de achttiende eeuw zou ook dit klooster ontbonden worden, door keizer Jozef II van Oostenrijk.

In het voorjaar van 1979 werd er in de Bethaniestraat een nieuw hoofdriool aangelegd. Stadsarcheoloog drs. Hans Jansen kreeg toen gelegenheid archeologisch onderzoek naar het klooster te verrichten. Aangetoond werd dat de bouw van de kerk daadwerkelijk in de tweede helft van de vijftiende eeuw heeft plaatsgevonden. Ook de skeletten werden nauwkeurig onderzocht, al leverde dit wel wat moeilijkheden op. Zo schrijft dhr. Janssen in zijn boek Van Bos tot Stad: 'Daarbij kwam nog dat gedurende de opgravingen een hond er in de nachtelijke uren met fragmenten van een skelet vandoor is gegaan.'

Na het verlaten van het klooster door de religieuzen werd het gehele complex in gedeelten verkocht. Paardestallen (vlak bij de kazerne die in de voormalige Sint-Jacobskerk, het huidige museum gevestigd was) en hovenierswoningen vulden het terrein. Tussen deze huizen en de stadsmuur bij de Hekellaan lagen tuinderijen. In de negentiende eeuw kwamen er enige arbeiderswoningen bij. Deze gehele middeleeuwse, achttiende- en negentiende-eeuwse bebouwing verdween zo'n vijftig jaar geleden, om plaats te maken voor de huidige woningen.